微流控技術(shù)及其在IVD領(lǐng)域的應(yīng)用

（原創(chuàng) 2023-08-10 CMDE 中國器審）

　　微流控技術(shù)^[1]（Microfluidics）指的是使用微管道（尺寸為數(shù)十到數(shù)百微米）處理或操縱微小流體（體積為微升到納升）的系統(tǒng)所涉及的科學(xué)和技術(shù)，是一門涉及化學(xué)、流體物理、微電子、新材料、生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)工程的新興交叉學(xué)科。微流控的早期概念可以追溯到19世紀(jì)70年代采用光刻技術(shù)在硅片上制作的氣相色譜儀，而后又發(fā)展為微流控毛細(xì)管電泳儀和微反應(yīng)器等。

　　因?yàn)榫哂形⑿突⒓苫忍卣鳎⒘骺匮b置通常被稱為微流控芯片，也被稱為芯片實(shí)驗(yàn)室（Lab on a Chip）和微全分析系統(tǒng)（micro-Total Analytical System）^[1]。微流控芯片采用類似半導(dǎo)體的微機(jī)電加工技術(shù)在芯片上構(gòu)建微流路系統(tǒng)，將實(shí)驗(yàn)與分析過程轉(zhuǎn)載到由彼此聯(lián)系的路徑和液相小室組成的芯片結(jié)構(gòu)上，加載生物樣品和反應(yīng)液后，采用微機(jī)械泵、電滲流等方法驅(qū)動(dòng)芯片中緩沖液的流動(dòng)，形成微流路，于芯片上進(jìn)行一種或連續(xù)多種的反應(yīng)^[2]。采用熒光、電化學(xué)、質(zhì)譜等分析手段，對樣品進(jìn)行快速、準(zhǔn)確和高通量的分析。

　　一、微流控技術(shù)的分類

　　在微流控技術(shù)中，微流體驅(qū)動(dòng)和控制技術(shù)是實(shí)現(xiàn)微流體控制的前提和基礎(chǔ)，其控制方式種類眾多，采用的原理和形式也不盡相同。根據(jù)微流體驅(qū)動(dòng)方式不同，微流控技術(shù)主要分為兩類：主動(dòng)型微流控和自趨式微流控^[3]。

　　主動(dòng)型微流控是利用外源性驅(qū)動(dòng)力（包括壓力、離心力、磁力、電潤濕等）進(jìn)行微流體操控的方式。壓力式微流控是利用氣壓或液壓或氣液壓混合，來控制液體在芯片中的運(yùn)動(dòng)。離心式微流控一般為對稱盤式構(gòu)型，利用旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的離心力來驅(qū)動(dòng)液體在芯片中的運(yùn)動(dòng)。磁力式微流控是利用磁場來控制流體中的磁性物質(zhì)，以驅(qū)動(dòng)流體的運(yùn)動(dòng)。數(shù)字化微流控一般基于電潤濕的基本原理，以多種方式操縱液滴，構(gòu)建電極陣列，實(shí)現(xiàn)復(fù)雜的生化分析。

　　自驅(qū)式微流控通常是指利用表面親疏水特性或毛細(xì)力來進(jìn)行流體的輸運(yùn)與處理的方式。其特點(diǎn)是自驅(qū)動(dòng)、無需額外泵源和能源。

　　二、微流控芯片技術(shù)的特點(diǎn)

　　基于微機(jī)電系統(tǒng)（MEMS）發(fā)展而來的微流控芯片技術(shù)，被譽(yù)為改變未來的七種技術(shù)之一，相比于傳統(tǒng)方法其技術(shù)有如下優(yōu)勢^[4]：

　　（一）集成小型化與自動(dòng)化

　　微流控技術(shù)能夠把樣本檢測的多個(gè)步驟集中在一張小小的芯片上，通過流道的尺寸和曲度、微閥門、腔體設(shè)計(jì)的搭配組合來集成這些操作步驟，最終使整個(gè)檢測集成小型化和自動(dòng)化。

　　（二）高通量

　　由于微流控可以設(shè)計(jì)成為多流道，通過微流道網(wǎng)絡(luò)可以同時(shí)將待檢測樣本分流到多個(gè)反應(yīng)單元，同時(shí)反應(yīng)單元之間相互隔離，使各個(gè)反應(yīng)互不相干擾，因此可以根據(jù)需要對同一個(gè)樣本平行進(jìn)行多個(gè)項(xiàng)目的檢測。與常規(guī)逐個(gè)項(xiàng)目檢測相比，大大縮短了檢測的時(shí)間，提高了檢測效率，具有高通量的特點(diǎn)。

　　（三）檢測試劑消耗少

　　由于集成檢測的小型化，使微流控芯片上的反應(yīng)單元腔體非常小，雖然試劑配方的濃度可能有一定比例的提高，但是試劑使用量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于常規(guī)試劑，大大降低了試劑的消耗量。

　　（四）樣本量需求少

　　由于只在幾厘米大小的芯片上完成檢測，因此需要被檢測的樣本量需求非常少，往往只需要微升甚至納升級別。同時(shí)由于其高通量的特點(diǎn)，對一次采集的樣本就可以實(shí)現(xiàn)多項(xiàng)測試，因此對于不易獲取的樣本檢測更加具有優(yōu)勢。

　　（五）污染少

　　由于微流控芯片的集成功能，原先在實(shí)驗(yàn)室里需要人工完成的各項(xiàng)操作全部集成到芯片上自動(dòng)完成，使人工操作時(shí)樣本對環(huán)境的污染降低到最低程度。例如在分子核酸類檢測中，氣溶膠的擴(kuò)散使得后續(xù)樣本檢測容易出現(xiàn)假陽性，微流控技術(shù)的使用很好的解決了這一問題。

　　同時(shí)，微流控芯片技術(shù)仍存在以下的不足：

　　（一）核心技術(shù)缺乏規(guī)范和標(biāo)準(zhǔn)

　　在微流控的產(chǎn)業(yè)化中，由于技術(shù)還不太成熟，產(chǎn)品缺乏相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化，目前還沒法實(shí)現(xiàn)組件的通用化。這樣也就沒法形成上下游公司合作式的開發(fā)模式。

　　（二）生產(chǎn)成本高昂

　　微流控產(chǎn)品本身就是結(jié)合微機(jī)電加工、生命科學(xué)、化學(xué)合成、光學(xué)工程及電子工程等許多領(lǐng)域?qū)W科的新產(chǎn)品，技術(shù)要求高，開發(fā)周期較長，導(dǎo)致生產(chǎn)成本升高。

　　（三）技術(shù)難題

　　比如對于微流控免疫分析芯片系統(tǒng)，抗體的固定、對微通道表面的封閉，顯著影響免疫分析的靈敏度，是該類芯片需要重點(diǎn)解決的問題。

　　另外，微流控芯片與外圍設(shè)備如自動(dòng)分析、顯示設(shè)備等的集成化也是需要重點(diǎn)攻克的難題。

　　三、微流控芯片與生物芯片的區(qū)別

　　微流控芯片指的是在一塊幾平方厘米的芯片上構(gòu)建化學(xué)或生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，它可以把所涉及的化學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域中的樣品制備、反應(yīng)、檢測，細(xì)胞培養(yǎng)、分選、裂解等基本操作單元集成到這塊很小的芯片上，用于完成不同的生物學(xué)和化學(xué)反應(yīng)過程，并通過由微通道形成的網(wǎng)絡(luò)，使微流體貫穿整個(gè)系統(tǒng)，用以實(shí)現(xiàn)常規(guī)化學(xué)或生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的各種功能。

　　生物芯片（biochip或bioarray）是根據(jù)生物分子間特異相互作用的原理，將生化分析過程集成于芯片表面，從而實(shí)現(xiàn)對DNA、RNA、多肽、蛋白質(zhì)以及其他生物成分的高通量快速檢測。狹義的生物芯片概念是指通過不同方法將生物分子固著于硅片、玻璃片、凝膠等固相遞質(zhì)上形成的生物分子點(diǎn)陣。因此生物芯片技術(shù)又稱微陣列列（microarray）技術(shù)^[7]。

　　微流控芯片是以微量流體的精確控制為核心技術(shù)，而生物芯片是以靜態(tài)的親和反應(yīng)配對為核心技術(shù)。從原理、應(yīng)用及發(fā)展目標(biāo)上看，它們都是芯片實(shí)驗(yàn)室，但它們各有自己的特點(diǎn)，它們分屬于不同的學(xué)科體系以及技術(shù)領(lǐng)域。在實(shí)際的研究和應(yīng)用當(dāng)中，各概念所涉及的技術(shù)往往是相互交叉的，例如生物芯片可單獨(dú)使用也可作為微流控芯片的一種檢測技術(shù)。    

　　四、微流控芯片在體外診斷領(lǐng)域的應(yīng)用

　　目前體外診斷是微流控技術(shù)的最大的應(yīng)用場景。國內(nèi)外體外診斷技術(shù)主要表現(xiàn)為自動(dòng)化、快速化、超高靈敏度、高通量檢測和無創(chuàng)化、微創(chuàng)化的發(fā)展趨勢。

　　（一）生化、免疫診斷檢測中的應(yīng)用

　　體外生化診斷檢測原理主要基于酶動(dòng)力學(xué)檢測，依靠酶催化底物產(chǎn)生信號。微流控芯片高通量及微型化的特點(diǎn)，可以解決生化檢測項(xiàng)目多、樣本消耗量大、試劑成本高等問題。目前，商品化的微流控生化分析芯片主要以離心式微流控芯片為主。將生物化學(xué)檢測中所涉及的全血標(biāo)本加樣、分離、定量、稀釋、反應(yīng)、檢測等基本操作步驟集成在微芯片上，以微通道網(wǎng)絡(luò)連接各個(gè)反應(yīng)腔室，通過離心力、毛細(xì)管力及虹吸閥等實(shí)現(xiàn)對流體的精確控制^[6]。

　　免疫檢測主要是基于抗原抗體的特異性生物識(shí)別機(jī)制進(jìn)行檢測，本身具有較高的特異性。有研究發(fā)現(xiàn)，在微流通道內(nèi)，當(dāng)流體動(dòng)力強(qiáng)度在0.1～10pN 時(shí)可以分裂抗原抗體的非特異性結(jié)合，而在6～250pN 時(shí)仍然可以保留抗原抗體的特異性結(jié)合^[8-10]，同時(shí)微流控技術(shù)平臺(tái)進(jìn)行的微流控分析所需試劑量極小，大大降低了抗體等昂貴免疫試劑的消耗。此外，微納尺度的流體操控與集成，不僅提高了抗原與抗體反應(yīng)的速度、有效縮短了反應(yīng)時(shí)間，并極大地簡化了免疫分析的操作過程。因此，微流控免疫分析技術(shù)在提高體外診斷檢測的特異性、靈敏度、精確性等檢測性能方面具有巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值^[5]。

　　（二）分子診斷檢測中的應(yīng)用

　　分子診斷在目前精準(zhǔn)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)所占的比重越來越大，腫瘤的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)、靶向藥物的篩選、胎兒的產(chǎn)前診斷等均有賴于分子診斷。而在微流控芯片方面，核酸擴(kuò)增技術(shù)同樣也發(fā)展最為成熟，基于不同類型的核酸擴(kuò)增方法均有大量報(bào)道，包括實(shí)時(shí)熒光定量PCR芯片、逆轉(zhuǎn)錄PCR芯片、液滴PCR芯片、數(shù)字PCR芯片等，以及基于恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增、滾環(huán)擴(kuò)增、重組酶聚合酶擴(kuò)增等手段的微流控芯片。在數(shù)字微流控芯片中少量的模板DNA和試劑被封裝在液滴或微孔內(nèi)，允許在相對傳統(tǒng)DNA擴(kuò)增方案（例如PCR）更短的時(shí)間內(nèi)分析珍貴的核酸樣品。目前微流控芯片已實(shí)現(xiàn)了分子診斷領(lǐng)域大部分的技術(shù)方法，包括基因分型、基因突變、單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)檢測、疾病相關(guān)微小RNA檢測，DNA測序等^[4]。

　　五、相關(guān)產(chǎn)品的注冊審評情況

　　目前經(jīng)注冊審評的產(chǎn)品主要包括基于不同芯片檢測方法的試劑，以及配套芯片使用的檢測設(shè)備。芯片類試劑主要集中為境內(nèi)注冊，目前已批準(zhǔn)境內(nèi)三類試劑40余項(xiàng)，由國家局批準(zhǔn)上市的芯片檢測相關(guān)的設(shè)備（境內(nèi)、進(jìn)口）共約10余項(xiàng)。境內(nèi)二類產(chǎn)品100余項(xiàng)。

　　早期的芯片試劑類產(chǎn)品均為生物芯片，主要用于核酸和蛋白的檢測，試劑以微陣列等形式提前包被在芯片中，如采用核酸雜交芯片或蛋白芯片進(jìn)行多項(xiàng)基因或抗體的檢測。我中心于2013年發(fā)布《生物芯片類檢測試劑注冊審查指導(dǎo)原則》對該類產(chǎn)品進(jìn)行注冊指導(dǎo)。

　　隨著微流控技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多不同微流控形式的試劑申報(bào)注冊，并經(jīng)批準(zhǔn)上市。有微陣列芯片、雜交芯片、PCR擴(kuò)增芯片、碟式芯片、毛細(xì)管電泳、電化學(xué)基因芯片等。申報(bào)的試劑檢測主要涵蓋病原體檢測、基因分型、基因多態(tài)性、遺傳基因、以及腫瘤標(biāo)志物的檢測；配套的檢測設(shè)備主要集中在恒溫?cái)U(kuò)增芯片分析儀、數(shù)字PCR分析儀、生物芯片閱讀儀等類別。

　　目前國內(nèi)產(chǎn)品的自動(dòng)化和微流控程度較低，主要產(chǎn)品類別仍舊集中在微流控程度不高的生物芯片、以及采用簡單離心方法進(jìn)行控制的PCR芯片，對配套設(shè)備的要求不高。

　　六、審評思考及提示

　　對于不涉及液路系統(tǒng)的生物芯片，參照其他試劑進(jìn)行整體的分析性能評價(jià)。對于存在微流控的芯片，針對碟片式芯片，需另外考慮轉(zhuǎn)速和離心力。針對其他液路控制的芯片，考慮液路管徑、流速、壓力等因素。還有些芯片中未包被試劑，此時(shí)芯片不做為試劑管理，試劑的申報(bào)資料中應(yīng)對配套使用的芯片進(jìn)行選擇研究。

　　對于主動(dòng)型芯片，即微流控過程完全由芯片自動(dòng)實(shí)現(xiàn)，配套設(shè)備參照常規(guī)設(shè)備產(chǎn)品要求；對于被動(dòng)型芯片，即微流控過程由配套設(shè)備施加外部動(dòng)力來實(shí)現(xiàn)，需要結(jié)合外部動(dòng)力的實(shí)現(xiàn)原理，評價(jià)相應(yīng)的機(jī)械定位、壓力、磁力等相關(guān)因素。